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1.菌種鑒定可以鑒定到種嗎?
  16s rRNA作為菌種鑒定相似度超過97%一般定義為同一種菌。
  如果是sanger測序獲得16s全長的都可以鑒定到種,甚至能區分亞種。有些細菌并不只有1個16s序列,會包含有1-15拷貝的16s序列,所以單一的16s序列鑒定可能會出現偏差。
  利用高通量如454或miseq測序一般由于讀長的緣故,通常只有300-500多個堿基被測序,所以在物種鑒定上一般比較可靠的是能分類到屬,部分能分類到種。
  根據我們的經驗,不同的樣品會有大約10-50的菌能分類到種。利用新的分析方法,我們現在也可以利用16s rRNA的群落多樣性高通測序數據進行亞種級別的分析。主要是利用16s中共同變化的SNP位點進行分型。這樣可以大大提高菌種的分類精度,尤其是在有些菌株之間表型差異巨大的時候。
2.菌種鑒定的方法簡介
  在做菌種鑒定之前,首先要確定待鑒定的菌種是不是純種,這也是至關重要的一步 。菌種不純是不會得到正確的結果的。純化方法,常用的有兩種
方法 原理 優點 缺點 例如
平板劃線分離法 把混雜在一起的微生物或同一微生物群體中的不同細胞用接種環在平板培養基,通過分區劃線稀釋而得到較多獨立分布的單個細胞,經培養后生長繁殖成單菌落,通常把這種單菌落當作待分離微生物的純種 可以觀察菌落特征,對混合菌進行分離 不能計數,一般用于從菌種的分離純化。 篩選大腸桿菌菌種。
稀釋涂布平板法 將菌液進行一系列的梯度稀釋,然后將不同稀釋度的菌液分別涂布到瓊脂固體培養基的表面,進行培養。在稀釋度足夠高的菌液里,聚集在一起的微生物將被分散成單個細胞,從而能在培養基表面形成單個的菌落。 可以計數,可以觀察菌落特征。 吸收量較少,較麻煩,平板不干燥效果不好,容易蔓延。一般用于平板培養基的回收率計數。 測定純凈水中大腸桿菌的含量。

菌種鑒定的方法一般有常規鑒定和分子生物學方法:

(1)常規鑒定:菌落形態觀察、革蘭氏染色、菌毛染色、糖類分解實驗、吲哚實驗、淀粉水解實驗、V-P實驗、甲基紅實驗、檸檬酸鹽利用實驗、硝酸鹽還原實驗、接觸酶實驗等

(2)分子生物學方法:細菌16SrDNA菌種鑒定:提取DNA,特定引物PCR擴增,PCR產物純化測序,進化樹分析;真菌18S rDNA/ITS菌種鑒定流程也是一樣的。

3.文獻中未知菌鑒定中有菌落特征的觀察,為什么不指明用何種培養基、培養基狀態(固、液)及培養條件(時長、溫度)?
  不同類型的菌在不同培養基上有顯著牲,尤其在顯色培養基上,更能一目了然,有輔助判定的作用;但未知菌無法確定在哪種培養基上生長好,以及生長條件等,所以食品安全控制中著重檢致病菌,比如檢驗是否有空腸彎曲菌,有一整套方法,42度,微厭氧條件比較合適,還要增菌;但未知菌不可能把這些條件都嘗試一下,我們的方法是全用營養瓊脂培養,如果需氧條件下不長,就再實驗一下厭氧條件,35度左右培養,時間以長出合適實驗的菌為宜.
4.菌種長時間保存后復蘇,如何鑒定有沒有改變?
(1).仔細觀察單菌落的形態結構,比較該單菌落與目的菌單菌落的外在特征,或者查找目的菌特有的生理生化特性,比較現有菌,一般可以作出判斷。

(2).如果不能輕易判斷,建議對菌株的16sRNA的基因序列進行測序,測序結果與數據庫中數據進行比對,建立個系統進化發育樹,這樣可以精確的判斷菌株是否發生改變。

5.微生物的菌種鑒定可以鑒定到"株"一級嗎?
  如果菌株是自然界中分離得到,就只能鑒定到種,不能鑒定到株,因為多多少少和其他株系的細菌有區別,即便你做了一些特征的鑒定,發現和某一株細菌一模一樣,你也沒有理由說你的細菌就是那一株細菌,因為你不可能把所有的特征都做完,株和株之間的關系就相當于不同的人之間的關系,世界上不可能有完全相同的兩個人。除非你知道你的細菌本來就是某一株細菌擴增出來的(而且要保證沒有變異,否則就是一個新株),可是這樣就沒必要鑒定了。
6.PCR擴增切膠純化測序出現套峰是什么情況?
(1)測序結果個別堿基出現N,或者部分連續出現套峰,是由菌種rDNA多態性造成,對菌種鑒定無影響;

(2)所有測序反應均出現大面積套峰,由于客戶提供樣品模板不純造成,這種情況需要客戶重新純化菌種或進行TA克隆。

7.常規鑒定中,如何判斷菌種質量?
(1).肉眼觀察:優良菌種菌絲濃白,絨狀,粗壯密集,生長整齊,速度快,香味濃厚。

(2).優良菌種標準可歸納為:"純、香、正、壯、潤"五個字。檢查時,打開瓶塞,從菌種瓶中部取出小塊菌絲體,觀察色澤,聞其氣味,手捏料塊檢查其含水量,看是否符合上述要求標準。

(3).顯微鏡檢查:挑取少量菌絲,置顯微鏡上觀察其形態,菌絲分枝,分隔情況,鎖狀聯合,細胞膜的厚薄。 培養觀察:從菌種瓶中挑取小塊菌絲體,接種斜面試管培養基上,置23℃~25℃恒溫中培養,經五周后檢查菌種生活力。如果菌絲生長快,旺盛純一,健壯濃厚,長且整齊,則表示菌種的生活力強。

(4).分塊法:在桌上放一張白紙,把菌齡相同的菌種從瓶內取出一大塊,用手分成2塊,再把2塊分成4塊,4塊 分成8塊,依次進行。優良菌種整塊多,碎渣少。劣次菌整塊少,碎渣多。

(5).液體菌種鑒別:當三角瓶或發酵缸培養3-7天后,如液面出現氣泡,產生"油皮"、混濁等現象,說明菌種本 身帶有雜菌。如菌塊上浮,或遲遲長出很薄的菌絲層,則說明菌種生活力弱。白塊四周的菌絲生長快、濃白、棉絮狀,表明菌種生命力強。

相關連接:

細菌16S rDNA菌種鑒定

真菌18S rDNA/ITS菌種鑒定

 

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