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WB實驗樣品準備及運輸要求
 
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1.Western Blot檢測樣本要求
  新鮮的樣品,組織(植物組織、動物組織)、細胞,由信諾金達負責提取蛋白。
  組織樣品:提供250-500mg新鮮樣品/樣;
  細胞樣品:提供1×106~1×107細胞/樣;
  以上樣品均需要干冰運輸。
  注:貼壁細胞的處理方法(冰上操作) 1) 轉染后的細胞,細胞刮直接刮下來,PBS重懸清洗,吹洗后離心(5000 rpm,4min)去上清-20℃保存,避免反復凍融。 2) 裂解液裂解,裂解后離心(12000 rpm,4min),取上清。
2.Western Blot檢測中為什么檢測無信號?(白板)
  大概總結為一下幾類原因:
  (1)樣品中目的蛋白豐度很低,低于實驗的檢測下限
  (2)一抗不識別檢測物種的蛋白,同時若有陽性參照的話提供陽性對照蛋白,若陽性對照正常則說明抗體及實驗參照沒有問題,可能是樣本中目的蛋白含量比較低。
  (3)蛋白降解
   (4)待測樣品的確為陰性;
  (5)一抗失效;
  (6)抗原量不足,每泳道蛋白上樣量不低于0.1ug。
3.Western Blot檢測中為什么選擇內參?
  內參也叫看家基因,在組織或細胞中都會表達,且表達量在不同組織或細胞中幾乎是相同的,一般有α-Tublin,β-actin,GAPDH等,在Western Blot中使用內參其實就是在Western Blot過程中用內參對應的抗體檢測內參。
  其作用有兩個:
  (1)看提取蛋白質量的好壞。如果做western的時候,內參蛋白有條帶,而目的蛋白沒有,說明蛋白的提取和轉膜等步驟沒有問題,是目的蛋白的抗體質量不好或者是稀釋倍數不對。
  (2)比較客觀的說明目的蛋白的表達情況,消除上樣量等的誤差。不同的樣品之間由于蛋白提取的量有差別,可能強陽性的表達跑出來的帶很弱。 因此設立內參照,比較不同樣品之間的表達情況。
3.Western Blot檢測中為什么內參條帶不一致?
  這個是正常現象。理論上,目的蛋白在對應總蛋白中的比例大致相同,內參和目的蛋白的比例也在相應組保持一致。同樣的,內參不一致的時候,上樣總蛋白量相同,但目的蛋白(內參蛋白)在不同樣品中提取后的內參蛋白量不一定是完全一致的,所以在進行Western Blot定量分析時會通過內參進行校正分析,最終獲得相對的表達量的分析結果。
4.Western Blot檢測中為什么檢測的結果分子量大小與實際不符?
  (1)翻譯后修飾—比如蛋白的磷酸化,糖基化等,這些都會增加蛋白的分子量大小。
  (2)翻譯后剪切—比如很多蛋白首先被合成為前體形式,然后通過剪切獲得生物學活性。
  (3)剪接變異體—相同的基因,經過選擇性剪接會產生不同分子量大小的蛋白。
  (4)相對電荷—氨基酸的組成 (帶電 vs 不帶電)。
  (5)多聚體—比如蛋白二聚體。

5.為什么檢測結果有很多雜帶?
  (1)可能是樣品本身體內表達的蛋白具有多種修飾形式如糖基化、磷酸化、乙酰化等;
  (2)若是細胞樣品,可能是細胞傳代次數過多,使其蛋白表達不同,可以使用傳達次數少的進行平行實驗一起做對照看看;
  (3)蛋白降解,導致蛋白分子量降低;
  (4)蛋白形成多聚體形式。
6.為什么Western Blot檢測的背景比較高?
  (1)可能抗體濃度較高;
  (2)抗原量較大;
  (3)一張膜中有的目的條帶較弱,為了能讓較弱條帶顯示出來,曝光時間較長。

7.為什么Western Blot的結果與QPCR結果趨勢不一樣?
  這種情況是比較正常的,Western Blot反映的是蛋白水平的結果,qPCR反映的是基因水平的結果。理論上蛋白水平與基因水平是一致的,但是mRNA的高低不代表其表達蛋白的高低。 也有一些基因可能在組織樣品中沒有正常翻譯,這樣即使qPCR檢測結果有表達,但是若蛋白沒有正常翻譯的話,Western Blot則檢測不到目的條帶。

相關連接:

Western Blot檢測

熒光定量PCR檢測

 

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